Akt I

Kyrkan San’t Andrea della Valle. Den politiske fången Cesare Angelotti har flytt från Castel Sant’Angelo i Rom. Han söker skydd i kyrkan där hans syster, markisinnan Attavanti, gömt kläder åt honom i familjekapellet. Konstnären Mario Cavaradossi arbetar med en altarmålning med bl a Maria Magdalena. Sakristanen påpekar dess likhet med en främmande kvinna som brukar besöka kyrkan (i själva verket markisinnan Attavanti).

Cavaradossi blir ensam. Angelotti kommer ut från sitt gömställe och känner igen sin vän Mario, även han en republikansk sympatisör. Utanför hörs den berömda operasångerskan Floria Tosca ropa Mario. Han ger Angelotti sin matkorg och uppmanar honom att gömma sig igen.

Tosca, Marios älskade, har hört deras röster i kyrkan och misstänker att han är otrogen. Misstankarna växer ytterligare när hon får syn på Marios målning. Han lyckas lugna henne och lovar att möta henne samma kväll i sin villa. Hon går.

Under tiden har Angelottis flykt upptäckts och det hörs kanonskott från kastellet. Cavaradossi bestämmer sig för att gömma Angelotti i sin villa och tillsammans skyndar de ut ur kyrkan.

Sakristanen återvänder med nyheten om Bonapartes nederlag och kyrkan fylls av människor som kommit för att sjunga ett Te Deum. Scarpia inträder med Spoletta och andra polismän för att söka efter flyktingen. Han hittar en solfjäder i kapellet och upptäcker markisinnan Attavantis vapen på den. När han får se Marios tavla och likheten mellan Maria Magdalena och markisinnan, samt hittar den tomma matkorgen, gissar Scarpia att Cavaradossi hjälpt Angelotti att fly. Tosca kommer in upprörd. Scarpia väcker hennes svartsjuka genom att visa henne solfjädern som bevis för Marios otrohet. Förtvivlad beslutar Tosca att överraska Mario i villan utanför staden. Hon skyndar ut och Scarpia ger Spoletta order om att följa efter henne.

Akt II

Palazzo Farnese. Scarpia superar i sitt rum i Palazzo Farnese. Utanför fönstret hörs musik från våningen tvärs över gården. Drottningen ger stor fest och Tosca medverkar. Scarpia befaller Sciarrone, hans kalfaktor, att lämna Tosca en biljett. Han skriver att han väntar henne när hon avslutat kantaten. Cavaradossi förs in. Han har arresterats av Spoletta men förnekar att han gömmer Angelotti.

Tosca kommer, oroad av innehållet i Scarpias biljett. Cavaradossi hinner knappt uppmana henne att tiga förrän han förs ner i den angränsande tortyrkammaren.

För att tvinga Tosca att tala ger Scarpia befallning om strängare tortyr. Till sist avslöjar hon förtvivlad att Angelotti är gömd i brunnen. Mario befrias från tortyren. När han förstår att Tosca avslöjat hemligheten förbannar han henne. Han avbryts av beskedet att Bonaparte oväntat segrat i slaget vid Marengo. Cavaradossi utbrister i leverop för friheten vilket får Scarpia att ge order om hans avrättning. Cavaradossi förs bort.

Tosca bönfaller Scarpia att skona Cavardossi. Hon är beredd att betala vilket pris som helst. Han kräver att hon ska ge sig åt honom. Man hör trummor utanför och Spoletta kommer in och berättar att Angelotti tagit sitt liv och att Cavaradossi förbereds för sin avrättning. Tosca ger nu vika mot löftet att Mario befrias. Scarpia ändrar dödsdomen. Cavaradossi ska för syns skull skjutas med lösa skott. Scarpia signerar ett fribrev som ger Tosca och hennes älskade fri lejd ut ur staden. När han omfamnar henne sticker hon ner honom med en kniv som hon hittat på bordet och han dör. Tosca tar fribrevet ur den dödes hand.

AKT III

Castel Sant’Angelo. Det är gryning och Cavaradossi förs ut på kastellets tak av en soldatpatrull. Hans tankar går till Tosca och han ber att som sista önskan få skriva några rader till sin älskade.

Tosca kommer och visar passet som gäller för dem båda. När de lämnats ensamma berättar hon vad som hänt och avslöjar Scarpias order om skenavrättning. Arkebuseringspatrullen marscherar in och Mario ställs på plats för att skjutas. Man hör en gevärssalva och Mario faller. Soldaterna tågar ut och Tosca skyndar fram till sin älskade. Men Mario är död. Scarpias ändrade order var ett bedrägeri. Röster närmar sig. Mordet på Scarpia har upptäckts. Spoletta och hans soldater kommer rusande för att gripa Tosca. Hon inser att hon är förlorad och springer fram till kanten och kastar sig ner från taket.